01

技术简介

酶联免疫吸附试验（- , ）系将固相载体上抗原－抗体的特异性反应与酶催化底物相结合而对样品中待测物进行定性或定量分析的方法。

根据检测目的和操作步骤不同（图1），技术一般可分为直接法（直接标记抗体、直接标记抗原）、间接法、竞争法（直接抗体竞争、直接抗原竞争、间接抗体竞争、间接抗原竞争）和夹心法（直接夹心、间接夹心和桥联），各种方法示意图详见图2。

技术具有高通量、信号读取方便、灵敏度高、操作简单和成本低等优点，广泛应用于生物原料药或制剂的鉴别试验、纯度分析、杂质分析、含量测定、生物活性/效价测定、免疫原性测定等。

图1. 基本操作步骤（USP-NF ）

图2.直接、间接、竞争、夹心、桥联示意图

（USP-NF ）

02

生物制品生物安全检测

2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）将生物制品分为4大类：1）预防类生物制品（含细菌类疫苗、病毒类疫苗）；2）治疗类生物制品（含抗毒素及抗血清、血液制品、生物技术制品等）；3）体内诊断制品；4）体外诊断制品（系指《中国药典》收载的、国家法定用于血源筛查的体外诊断试剂）。

生物制品是采用生物技术制备而成的具有活性的药品（含诊断制品），其研发和生产工艺复杂且易受多种因素影响；研发和生产过程中使用的各种原材料及辅料来源复杂（包括但不限于：细菌、病毒等微生物，人和动物组织、细胞和体液等的提取物，基因重组技术产生的某些产物），可能引入外源因子或毒性化学材料；制品组成成分复杂且一般不能进行终端灭菌，制品的质量控制仅靠成品检定难以保证其安全性和有效性。因此，对生物制品从研发到生产全流程进行严格的质量控制，是保证其安全有效的必要措施。

03

技术在生物制品生物安全检测中的应用

3.1.《中国药典》中使用技术的通则和体外诊断（IVD）试剂盒

《中国药典》中有12个通则和5个体外诊断试剂盒使用了技术（表1），包含蛋白残留、蛋白鉴别、生物活性/效价测定、含量测定4种类型的应用。

表1.《中国药典》中使用技术的通则和体外诊断试剂盒

3.2.技术在蛋白残留检测中的应用3.2.1.宿主细胞蛋白（ , HCPs）残留检测

大量生物制品是通过宿主细胞（例如：细菌、酵母、哺乳动物、昆虫、植物细胞系）生产的。生物制品中残留的HCPs对其安全性、有效性及稳定性均有影响，因此，生物制品中HCPs残留检测至关重要。《中国药典》中HCPs的残留检测涉及大肠埃希菌、假单胞菌、酵母工程菌、Vero细胞、CHO细胞、地鼠肾细胞、小鼠骨髓瘤细胞等宿主来源的蛋白残留检测，且对各生物制品中HCPs残留量均有明确的要求。法是各国药典、国际组织推荐用于检测HCPs残留量的金标准。

3.2.2.卵清蛋白残留检测

以鸡胚为宿主生产的疫苗（如流感疫苗、黄热疫苗等）中存在卵清蛋白残留风险。卵清蛋白作为一种异源蛋白，在疫苗接种后，特定人群可能会产生过敏反应，对于高致敏者，甚至会引起危及生命的严重反应。《中国药典》中《黄热减毒活疫苗》、《流感全病毒灭活疫苗》、《流感病毒裂解疫苗》明确要求对成品中卵清蛋白的残留量进行检测，且对残留量进行了严格限定（采用法检测分别不高于5 µg/剂、不高于250 ng/剂、不高于200 ng/剂）。

3.2.3.牛血清白蛋白（BSA）残留检测

疫苗、细胞治疗、干细胞以及组织工程产品等生物制品均要求进行BSA残留量的检测，保证相关生物制品的安全性。《中国药典》中有25种疫苗明确要求对BSA残留量进行检测（通则牛血清白蛋白残留量测定法），且对残留量进行了严格限定（采用技术检测，一般要求不高于50 ng/剂或不高于50 ng/mL）。

3.2.4.核酸酶残留检测

核酸酶是一类可以高效降解DNA和RNA分子的水解酶，广泛使用于生物制品中核酸的去除。生物制品中残留的核酸酶不仅会降低生物制品的活性，作为一种外源蛋白，其进入人体内，还会引起毒性或免疫反应。生物制品中残留的核酸酶对其有效性及安全性均有影响，因此，生物制品中核酸酶残留检测至关重要。核酸酶残留检测方法较多，法是众多方法中较为常用的一种方法。

3.2.5. 人免疫球蛋白A（IgA）残留检测

《中国药典》中有4种治疗类生物制品（《静注乙型肝炎人免疫球蛋白(pH4)》、《冻干静注乙型肝炎人免疫球蛋白(pH4)》、《静注人免疫球蛋白(pH4)》、《冻干静注人免疫球蛋白(pH4)》）明确要求对人IgA残留进行检测，可采用法进行检测（通则人免疫球蛋白类制品IgA残留量测定）。

3.2.6.鼠免疫球蛋白G（IgG）残留检测

对于采用单克隆抗体亲和色谱法纯化的治疗类生物制品（如各种人干扰素制品），应进行鼠IgG残留检测。《中国药典》中有10种人干扰素制品明确要求对鼠IgG残留量进行检测，采用法进行检测（通则鼠IgG残留量测定法），每1次人用剂量鼠IgG残留量应不高于100 ng。

3.2.7.蛋白质A（）残留检测

当应用进行抗体纯化时，因工艺、pH、添加剂不同或填料老化， A会不可避免的发生脱落，残留的对抗体药的安全性和有效性具有潜在的安全隐患。《中国药典》中《尼妥珠单抗注射液》和《康柏西普眼用注射液》对的残留量均有明确要求，采用法检测，残留量要求分别为：不高于蛋白质总量的0.001%、每1 mg康柏西普应不高于20 ng。

3.3.技术在抗生素残留检测中的应用

抗生素属于工艺相关杂质，各国药典均对生物制品中抗生素的使用进行了严格限制。《中国药典》规定，生物制品生产过程中加入抗生素（卡那霉素等），则需进行抗生素残留检测：采用酶联免疫吸附法（通则）检测，成品中抗生素残留应不高于50 ng/剂。

3.4.技术在生物毒素残留检测中的应用

生物毒素是一类具有生物作用机制的毒性化学物质，主要包括植物毒素、动物毒素、微生物毒素和海洋毒素。微生物毒素（如霍乱毒素）是可能存在于生物制品中的有毒污染物，必须对其残留量进行严格限制。《中国药典》将霍乱毒素列为高风险原材料（第4级），《重组B亚单位/菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）》对霍乱毒素的残留量要求如下：采用间接法检测霍乱毒素残留量，每5.0×1010菌中含霍乱毒素不高于10 ng。

3.5.技术在病毒检测中的应用

3.5.1.病毒抗原含量测定

疫苗制品在原液、半成品、成品阶段需要对病毒抗原含量进行检测，且各阶段需要符合不同的要求。《中国药典》明确规定使用法进行疫苗制品的病毒抗原检测。技术还可用于疫苗制品的抗原表达率、病毒滴定、铝吸附效果测定试验及铝吸附完全性试验等类别试验中的病毒抗原含量测定。

3.5.2.病毒抗体含量检测

《GB/T .50-2001实验动物 酶联免疫吸附试验》详细介绍了使用间接技术检测动物病毒抗体的方法。

技术广泛应用于人源病毒抗体含量检测。丙型肝炎病毒抗体（HCV-Ab）、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-Ab）及梅毒螺旋体抗体（TP-Ab）的血清学诊断，均需依法采用技术的IVD试剂盒进行检测。

3.5.3.病毒滴度检测

对于采用人类免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒载体开发的细胞治疗产品，滴度是病毒载体生物学活性和含量的重要检测项目，可用于工艺过程监控和放行检测，需选择灵敏度、准确度、精密度等符合要求的检测方法开展研究。《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》推荐采用法检测载体样本中的p24蛋白从而进行物理滴度的检测（检测时应关注游离p24蛋白对结果的影响）。

技术还广泛应用于腺相关病毒（AAV）的颗粒滴度检测。

3.5.4.外源性逆转录病毒污染检测

已知鸡胚成纤维细胞（CEF）或其他禽源性细胞含有逆转录病毒序列，常可产生缺陷型逆转录病毒颗粒（如禽白血病病毒、禽网状内皮病肿瘤病毒）。《中国药典》中有3种疫苗（《黄热减毒活疫苗》、《流感全病毒灭活疫苗》、《流感病毒裂解疫苗》）明确要求在种子批毒种检定阶段对外源性禽白血病病毒采用法（通则）进行检测，且结果应为阴性。

3.5.5.病毒灭活验证效果检测

灭活病毒类疫苗的原液一般由纯化及除菌过滤后的病毒经甲醛灭活后制备，法可用于评价病毒灭活效果。《中国药典》中《甲型肝炎灭活疫苗（人二倍体细胞）》要求对原液进行病毒灭活验证试验，具体要求为：用酶联免疫吸附法（通则3429）检测甲肝病毒，应为阴性。

04

恒驭生物基于技术的生物安全检测服务

恒驭生物可提供病毒清除灭活研究、细胞库检测、原材料检测、细胞及基因治疗产品载体表征、工艺残留物检测等服务。其中基于技术的生物安全检测服务，涵盖鼠源性外源病毒因子检查（通过抗体产生试验检测种属特异性病毒）、宿主细胞蛋白（HCPs）残留、BSA残留、核酸酶残留、卡那霉素残留、腺相关病毒（AAV）颗粒滴度、p24蛋白含量等检测服务，欢迎咨询、交流。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社, 2020.

[2] The . The [M]. :The ,2022.

[3]国家药品监督管理局药品审评中心.细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点.

[4]国家药品监督管理局药品审评中心.人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）.

[5]国家药品监督管理局药品审评中心.体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.实验动物 酶联免疫吸附试验: GB/T .50-2001[S].北京:中国标准出版社, 2002.

往期回顾